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020-86438890
品牌 | 其他品牌 | 貨號 | Q711-02 |
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規(guī)格 | 500rxn | 供貨周期 | 現(xiàn)貨 |
主要用途 | 實(shí)時熒光定量 | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 醫(yī)療衛(wèi)生,環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)業(yè) |
qPCR熒光定量是指在反應(yīng)體系中加入熒光基因,利用熒光信號積累實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程,后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。
qPCR熒光定量技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍,而且與常規(guī)PCR相比,具有特異性更強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快、全封閉反應(yīng)、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點(diǎn),已成為*的核酸分子定量的標(biāo)準(zhǔn)方法,目前在基因表達(dá)研究和臨床疾病檢測等領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用(如轉(zhuǎn)基因動植物檢測、RNAi基因失活率檢測、病原微生物或病毒含量檢測、基因差異表達(dá)、基因分型)。
AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix
圖1.廣闊的定量閾
以HeLa 細(xì)胞cDNA 為稀釋液,將pUC19 質(zhì)粒進(jìn)行7 個10 倍梯度稀釋,第7 個稀釋梯度中質(zhì)??截悢?shù)濃度約為7 copies/4 μl。使用AceQ® Universal 預(yù)混液對各稀釋梯度中的pUC19 質(zhì)粒進(jìn)行檢測,每孔模板使用量為4 μl??梢钥吹剑珹ceQ®Universal預(yù)混液在寬廣的模板量區(qū)間內(nèi)具有線性關(guān)系,可輕松檢測出個位數(shù)拷貝的待測模板。
圖2.產(chǎn)品的特異性
對隨機(jī)選取的38 個體系進(jìn)行qPCR 檢測,驗(yàn)證AceQ® Universal預(yù)混液擴(kuò)增特異性。通過對融解曲線分析可知,38 個體系均無非特異性擴(kuò)增。說明AceQ® Universal 預(yù)混液擁有的特異性。
圖3.全平臺通用
使用AceQ® Universal 預(yù)混液在不同類型的qPCR 儀(機(jī)型:StepOnePlusTM、QuantStudioTM 3、LightCycler® 96)上擴(kuò)增GAPDH 基因,定量結(jié)果很好。說明AceQ® Universal 預(yù)混液儀器適用性廣,無需針對不同儀器調(diào)整ROX 濃度。
本產(chǎn)品是使用SYBR Green I 嵌合熒光法進(jìn)行qPCR的試劑,采用化學(xué)法修飾的熱啟動DNA聚合酶AceTaq® DNA Polymerase,配合針對qPCR優(yōu)化的適Buffer,可以有效抑制非特異擴(kuò)增,從而顯著提高擴(kuò)增效率,適用于進(jìn)行高靈敏度的qPCR反應(yīng)。本產(chǎn)品是一種含有qPCR反應(yīng)適濃度SYBR Green I的2 × 預(yù)混試劑,可以在寬廣的定量區(qū)域內(nèi)得到良好的標(biāo)準(zhǔn)曲線,對靶基因進(jìn)行準(zhǔn)確定量、檢測,重復(fù)性好,可信度高。另外,產(chǎn)品中含有特殊的ROX Passive Reference Dye,適應(yīng)于所有qPCR儀器,無需在不同儀器上調(diào)整ROX的濃度,只需在配制反應(yīng)體系時加入引物和模板即可進(jìn)行擴(kuò)增。
Q1:如何判斷CT值有效性?
A1:(1) 融解曲線單峰(染料法)
(2) 擴(kuò)增曲線指數(shù)擴(kuò)增區(qū)域,復(fù)孔間CT值STD<0.2
(3) 閾值設(shè)置合理
(4) NTC確認(rèn)無氣溶膠污染或可以忽略
(5) NRT確認(rèn)無基因組殘留污染或可以忽略
(6) 擴(kuò)增效率符合近似計算標(biāo)準(zhǔn),標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2大于0.98,擴(kuò)增效率e介于95-105%或者90-120%之間。
Q2:常見的擴(kuò)增曲線異常有哪些,如何解決?
A2:(1) 擴(kuò)增曲線不光滑:信號太弱,經(jīng)系統(tǒng)矯正后產(chǎn)生。建議提高模板濃度重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
(2) 擴(kuò)增曲線斷裂或下滑:一般由于模板濃度較高,基線的終點(diǎn)值大于CT值。建議減小基線終點(diǎn)(CT值-4),重新分析數(shù)據(jù)。
(3) 個別擴(kuò)增曲線突然驟降:反應(yīng)管內(nèi)留有氣泡,由于溫度升高后氣泡破裂,使儀器檢測到的熒光值突然降低所致。建議反應(yīng)前要仔細(xì)檢查反應(yīng)管內(nèi)是否有氣泡殘留。
(4) 擴(kuò)增曲線呈鋸齒狀且不連續(xù):ROX添加不當(dāng)。需校正參比染料。
Q3:標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增效率小于90%或者大于120%,線性關(guān)系不佳。
A3:(1) 加樣誤差。加大模板稀釋倍數(shù),提高加樣體積。加大稀釋體積,使不同稀釋梯度的濃度更準(zhǔn)確。
(2) 標(biāo)準(zhǔn)品降解。重新制備標(biāo)準(zhǔn)品,重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
(3) 模板濃度過高。存在反應(yīng)抑制,增加模板稀釋倍數(shù)。
(4) 引物擴(kuò)增特異性不好。重新設(shè)計引物,重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
Q4:在定量時,如何判斷cDNA投入量。
A4:*得到的cDNA需要進(jìn)行多個梯度稀釋,將不同梯度稀釋的cDNA進(jìn)行qPCR定量,選取CT值落在18-28,或者15-33范圍內(nèi)的擴(kuò)增曲線對應(yīng)的cDNA 稀釋梯度作為后續(xù)該基因的參考稀釋度(CT值在18-28,或者15-33區(qū)間范圍被認(rèn)為是準(zhǔn)確的)。有一點(diǎn)需要注意,當(dāng)使用cDNA原液進(jìn)行檢測的時候,使用量不能超過 qPCR體系的1/10,因?yàn)閏DNA中包含很多抑制qPCR的組份,使用體積過大會導(dǎo)致擴(kuò)增失敗。
Q5:如何確定基因表達(dá)量高低。
A5:如果基因擴(kuò)增CT值超過30,使用PCR產(chǎn)物通過梯度稀釋創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線,判斷該引物擴(kuò)增效率,若擴(kuò)增效率滿足90-120%,則可以判斷該基因擴(kuò)增CT值偏大是由于基因表達(dá)量低所致。
Q6:陰性對照出現(xiàn)明顯擴(kuò)增。
A6:(1) 反應(yīng)體系污染。更換新的Mix、水、引物重復(fù)實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)體系在超凈工作臺內(nèi)配制,減少氣溶膠污染。
(2) 擴(kuò)增為引物二聚體引起。配合融解曲線進(jìn)行分析。
Q7:NRT出現(xiàn)明顯擴(kuò)增。
A7:NRT出現(xiàn)明顯擴(kuò)增,說明存在基因組污染,可通過實(shí)驗(yàn)組和NRT的CT值來判斷實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)是否可用。當(dāng)實(shí)驗(yàn)組CT值與NRT的CT值差值大于5,說明由gDNA導(dǎo)致的誤差小于5%,則可以忽略gDNA污染;若實(shí)驗(yàn)組與NRT的CT值差值小于3或者幾乎一致,則實(shí)驗(yàn)組擴(kuò)增產(chǎn)物的模板很大一部分來源于gDNA,這樣的實(shí)驗(yàn)組就失去定量意義,建議使用去基因組的RNA提取試劑盒進(jìn)行RNA提取,或者反轉(zhuǎn)錄時,加入去基因組步驟。
Q8:CT值出現(xiàn)太晚。
A8:(1) 擴(kuò)增效率極低。優(yōu)化反應(yīng)條件,嘗試三步法擴(kuò)增程序,或者重新設(shè)計合成引物。
(2) 模板濃度太低。減少稀釋度重復(fù)實(shí)驗(yàn),一般未知濃度的樣品先從Zui高濃度做起。
(3) 模板降解。重新制備模板,重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
(4) PCR產(chǎn)物太長。推薦PCR產(chǎn)物長度為80 bp-150 bp。
(5) 體系中存在PCR抑制劑。一般為模板帶入,加大模板稀釋倍數(shù)或者重新制備模板重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
Q9:反應(yīng)結(jié)束無擴(kuò)增曲線出現(xiàn)。
A9:(1) 反應(yīng)循環(huán)數(shù)不夠。一般設(shè)置循環(huán)數(shù)為40,但需要注意的是過多的循環(huán)會增加過多的背景信號,降低數(shù)據(jù)可信度。
(2) 確認(rèn)程序中是否設(shè)置了信號采集步驟。兩部法擴(kuò)增程序一般將信號采集設(shè)置在退火延伸階段;三步法擴(kuò)增程序應(yīng)當(dāng)將信號采集設(shè)置在72℃延伸階段。
(3) 確認(rèn)引物是否降解。長時間未使用的引物應(yīng)先通過PAGE電泳檢測完整性,以排除引物降解的可能性。
(4) 模板濃度太低。減少稀釋度重復(fù)實(shí)驗(yàn),一般未知濃度的樣品先從Zui高濃度做起。
(5) 模板降解。重新制備模板,重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
Q10:融解曲線出現(xiàn)多峰。
A10:(1) 引物設(shè)計不優(yōu)。根據(jù)qPCR設(shè)計原則設(shè)計、合成新的引物。
(2) 引物濃度太高。適當(dāng)降低引物濃度。
(3) cDNA模板帶有基因組污染。重新制備cDNA模板。
Q11:實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差。
A11:(1) 加樣體積失準(zhǔn)。使用準(zhǔn)確度較好的移液槍,擴(kuò)大反應(yīng)體積,將模板做高倍稀釋,以大體積加入反應(yīng)體系中。
(2) 定量PCR儀不同位置溫度控制不一致。定期校準(zhǔn)儀器。
(3) 模板濃度太低。模板濃度越稀,重復(fù)性越差,減少模板稀釋度或提高加樣體積。
(4) 做4-6個復(fù)孔,刪除其中重復(fù)性不好的孔,將剩余的進(jìn)行后續(xù)計算。
Q12:高GC含量的模板,建議用什么產(chǎn)品進(jìn)行定量?
A12:建議用Q111進(jìn)行定量。
Q13:如果內(nèi)參CT值很低,目標(biāo)基因CT值很高,該如何稀釋樣品?
A13:可以在定量內(nèi)參的時候?qū)⒛0逑♂?,而定量目的基因時模板不稀釋,結(jié)果仍舊采用 2-ΔΔCT進(jìn)行計算,CT值減兩次,稀釋倍數(shù)會被相應(yīng)減掉,但要保證不同樣品在檢測同一基因時稀釋倍數(shù)要一致。
Q14:如何預(yù)防氣溶膠污染?
A14:在加樣的時候要小心操作,盡量在超凈工作臺中進(jìn)行加樣,并注意通風(fēng)。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后,盡量不要打開產(chǎn)物的管蓋,不要跑膠,跑完后需要妥善處理。如果氣溶膠污染情況很嚴(yán)重,建議采用通風(fēng)結(jié)合含強(qiáng)氧化劑的消毒液進(jìn)行處理。
Q15:相對定量為什么要做標(biāo)準(zhǔn)曲線?
A15:相對定量分析中采用2-ΔΔCT公式進(jìn)行計算比較不同樣品中基因的表達(dá)量時,前提是該體系的擴(kuò)增效率e是盡可能接100%的。相對定量中做標(biāo)準(zhǔn)曲線的目的就是為了判斷該擴(kuò)增體系中的擴(kuò)增效率e是否是接近100%,能否用2-ΔΔCT公式進(jìn)行計算;如果擴(kuò)增效率e與100%相差很大,在比較基因表達(dá)差異時是需要帶入實(shí)際的擴(kuò)增效率進(jìn)行計算的。
Q16:怎么做定量?
A16:首先需要有一個已知拷貝數(shù)濃度的樣品作為標(biāo)準(zhǔn)品,將其稀釋至少5個梯度后和待測樣品同時上機(jī)進(jìn)行定量檢測,以標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的Log值為橫坐標(biāo),以標(biāo)準(zhǔn)品的CT值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,將檢測獲得的待測樣品的CT值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中就能求得待測樣品的拷貝數(shù)濃度。
Q17:模板的稀釋液選擇。
A17:稀釋模板可以使用購買的Nuclease-free water、DEPC水或者實(shí)驗(yàn)室自備的ddH2O等。TE里有EDTA會抑制酶的活性,不可作為稀釋液。
上一產(chǎn)品:神經(jīng)細(xì)胞傳感
下一產(chǎn)品:10270-106gibco澳洲胎牛血清
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