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細胞凍存步驟:
細胞復(fù)蘇步驟:
常見注意事項: (廣州市超博科技有限公司)
有關(guān) DMSO 的一些注意事項:??
DMSO 能夠快速穿透細胞膜進入細胞中,降低冰點、延緩凍存過程,同時提高細胞內(nèi)的離子 濃度、減少細胞內(nèi)冰晶的形成,從而減少細胞損傷程度。
DMSO 在溶解過程中會放熱,應(yīng)先與培養(yǎng)基混勻后再加血清,同時凍存液需要提前配置, DMSO 現(xiàn)配對細胞的毒性可能更大;
復(fù)蘇時,要離心去除 DMSO,并用新鮮的培養(yǎng)基洗滌 1-2 次,注意離心的時候速度不要太快;
2. 血清需要比正常養(yǎng)細胞時多加,一般為 10%-20%。
3. 解凍時,要盡快將凍存管整體溫度上升至 37 攝氏度,由于凍存管具有一定的厚度,故 而可以將水浴鍋的溫度調(diào)至 40 攝氏度左右,可以縮短解凍時間。
4. 梯度凍存,即可以按照-4℃-->20℃~40℃-->80℃-->液氮的順序程序性降溫。
知識點思維擴散:
1972 年,冷凍損傷的兩因素假說:冰晶損傷和溶液損傷假說被 Mazur 等人首先提出,
他們是根據(jù)中國倉鼠組織培養(yǎng)細胞的低溫保存實驗數(shù)據(jù)分析得到的。
冰晶損傷假說認為隨著溫度的下降,細胞內(nèi)外的水分結(jié)冰,所形成的冰晶會造成細胞膜
和細胞器的破壞并引起細胞死亡。這種因細胞內(nèi)部結(jié)冰而致的細胞損傷即就是冰晶損傷
(Intracellular ice damage)。冰晶損傷是由冷卻速度過快造成,冷卻速度越快,冰晶損傷越大。
溶液損傷解說認為隨著溫度的下降,細胞外部的水分會先結(jié)冰,從而使得未結(jié)冰的溶液
中電解質(zhì)濃度升高,細胞膜上的脂質(zhì)會因長時問暴露在高溶質(zhì)的溶液中而受到損壞,細胞發(fā)
生滲漏,導(dǎo)致在復(fù)溫時大量水分滲入細胞內(nèi)造成細胞死亡。這種因保存溶液溶質(zhì)濃度增高而
致的細胞損傷被稱為溶液損傷(Solution damage)。溶液損傷是由冷卻速度過慢,使細胞在高
濃度的溶液中暴露的時間過長而造成,冷卻速度越慢,此損傷越嚴重。
作者:老談
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